Bacteriología anaeróbica práctica (página 2)

Se considera que las bacterias
anaeróbicas están presentes en la mayoría de
los procesos
infecciosos, ya como agente principal, o como secundario al
daño
tisular producido. En muchas ocasiones, éstas bacterias
pasan desapercibidas por diversas razones entre las que
predominan la mala colección, transporte y
conservación de la muestra, el uso
de medios
inadecuados para su aislamiento, su lento crecimiento, la
creencia en que si se ha aislado un microorganismo, ya no hay que seguir buscando y en
muchos casos, porque el microbiólogo no pensó en
anaerobios.

En la actualidad existen varios sistemas
automatizados y semiautomatizados para la identificación
de éstos microorganismos. Sin embargo, adicional a las
limitaciones que la literatura especializada
enumera, ninguno de ellos puede ser útil sin los pasos
previos de colección, procesamiento y aislamiento, los
cuales son la base de las buenas prácticas de trabajo en la
microbiología básica.

Todas estas dificultades propias de
la
investigación en las que el
conocimiento de la flora normal y patológica tiene una
gran importancia en la búsqueda de los anaerobios, nos ha
estimulado en la realización de éste resumen de
técnicas para la detección e
identificación de estos microorganismos cuya evaluación
requiere un trabajo mas fino por parte del
microbiólogo.

Relación
de las bacterias con el oxígeno

Ref. Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology (9th ed., 1994).

En base a la relación de las
bacterias con el oxígeno, estas se pueden clasificar en
:

• Aerobio estricto : Un organismo
  el cual requiere utilizar el oxígeno como aceptador
  terminal de electrones , puede tolerar un nivel del
  oxígeno equivalente o mayor de una atmósfera de
  aire (oxígeno del 21%), y tiene un tipo
  terminantemente respiratorio de metabolismo.

• Anaerobio facultativo: Un
  organismo que puede crecer bien en ausencia del
  oxígeno y en la presencia de un nivel de
  oxígeno equivalente a una atmósfera del aire
  (oxígeno de 21%).

• Microaerofílico : Un
  organismo que es capaz de un crecimiento
  oxígeno-dependiente, pero no puede crecer en la
  presencia de un nivel del oxígeno equivalente a una
  atmósfera de aire (oxígeno de 21%).

• Anaerobio estricto : Un
  organismo que es incapaz de crecimiento
  oxígeno-dependiente y no puede crecer en la presencia
  de una concentración de oxígeno equivalente a
  una atmósfera de aire (oxígeno de
  21%).

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL
OXIGENO EN
TIOGLICOLATO

Tubo # 1: Aerobio estricto

Tubo # 2: Anaerobio facultativo

Tubo # 3: Anaerobio aerotolerante (
Microaerofílico )

Tubo # 4: Anaerobio estricto

Recolección y transporte de muestras
clínicas

Las muestras clínicas deben ser
obtenidas del sitio infectado usando procedimientos
que garanticen el mantenimiento
de una atmósfera carente de
oxígeno y eviten contaminación con flora endógena. En
general el procedimiento
recomendado es aspiración con aguja del material purulento
o por biopsia después de desinfección
apropiada.

Estas muestras deben ser procesadas en el
laboratorio lo
más rápido posible, manteniendo en todo momento su
estado libre
de oxígeno. La obtención de muestras son aceptables
solo en casos de incluir un medio de transporte apropiado para
anaerobios y sean  sembradas antes de 30 minutos de obtenida
la muestra.  Las muestras para cultivos anaeróbicos
nunca deben ser refrigeradas.

La aspiración directa con aguja es
el mejor método de
obtener una muestra representativa para cultivo. Los especimenes
obtenidos de los líquidos normalmente estériles
tales como sangre,
líquido cefalorraquídeo o peritoneal, se recogen
después de la descontaminación cuidadosa de la
piel.

Los dispositivos del transporte contienen
generalmente ambiente libre
de oxígeno proporcionados por una mezcla del
bióxido de carbono,
hidrógeno, nitrógeno, más un
indicador aerobio de la condición. Los especimenes se
deben poner en un transportador anaerobio cuanto antes. Los
especimenes se inoculan en un frasco anaerobio del transporte o
una jeringuilla con aguja. Después de que se expelan todas
las burbujas de aire, el extremo
de la aguja se debe insertar en un tapón de caucho
estéril, ya que el aire puede difundirse gradualmente a
través de la pared plástica de la jeringuilla.
Recomendamos el Manual de Colección de Muestras
Microbiológicas que hemos redactado en
compañía del Dr. Silvio Vega.

A pesar de que las bacterias aerobias y
anaerobias son indistinguibles por la tinción, el frotis
directo proporciona información preliminar importante con
respecto a tipos de organismos presentes, sugiere terapia inicial
apropiada y sirve como control de
calidad. Estos anaerobios pueden mostrar un patrón
morfológico típico que puede ser reconocido por un
microscopista experimentado. Recomendamos muy especialmente el
frotis directo por Gram de la muestra para ayudar a evaluar el
cultivo posterior.

Flora
anaeróbica normal

Las bacterias anaerobias forman parte de la
microbiota normal del cuerpo humano
y de los animales. Se
encuentran como comensales, en algunos casos con funciones
fisiológicas importantes. No obstante, también
pueden dar lugar a procesos infecciosos graves. Aunque el hombre es
un aerobio, más del 99.9% de la flora humana normal son
anaerobios estrictos y facultativos. Éstos
incluyen:

Piel – Propionibacterium spp
(Produce ácido propiónico )

Boca – Actinomyces, Prevotella,
Porphyromonas, Peptostreptococcus

Intestino grueso – Bacteroides
spp, Bifidobacterium spp,
Clostridium

perfringens,
Peptostreptococcus

Vagina – Lactobacillus, Prevotella
spp

4.1 Microbiota de la
piel.

Propionibacterium es el
único anaerobio habitualmente presente en la piel,
mientras que Eubacterium lo es esporádicamente.
En las zonas próximas al área peritoneal se pueden
encontrar bacterias intestinales, como Clostridium y
Bacteroides, que condicionan de manera distinta el tipo de
infecciones de las regiones próximas a la
misma.

4.2 Microbiota de la cavidad
oral.

El sistema
ecológico de la boca es muy complejo. En él se
encuentran diferentes hábitat, tales como mucosas de distinta
clase de
epitelios, la placa dentaria, etc., con interrelaciones entre
ellos mismos y el resto del medio
ambiente. Los factores que pueden afectar este sistema son
muchos y variados: el lugar donde se vive, la edad, el estado de
la dentición, el tipo de alimentación, las
alteraciones en la dentadura, los hábitos
higiénicos, la cantidad de saliva, la forma de respirar,
el potencia Eh, la
cantidad de lisozima, las peroxidasas, la producción de inmunoglobulinas, la
capacidad fagocitaria de los leucocitos, el efecto de substancias
antimicrobianas y otros. En la cavidad oral, es casi constante la
presencia de bacterias anaerobias y microaerófilas, con
predominio de Streptococcus, Peptostreptococcus,
Fusobacterium, Prevotella, Bifidobacterium, Propionibacterium,
Eubacterium, espiroquetas y Actinomyces.

La concentración de bacterias en la
saliva es de 108 por ml, la de la superficie de los dientes de
109 y la de los raspados gingivales es superior, pudiendo llegar
a 1012 por ml. La proporción de anaerobios y aerobios es
variable: de 1 a 1 en la saliva y de 1000 a 1 en el surco
gingival.

Cuando se pasa de la cavidad oral hacia la
laringe, las bacterias prácticamente desaparecen; el resto
de las vías respiratorias y los pulmones se consideran
estériles.

4.3 Microbiota del tracto
digestivo.

En condiciones normales, debido al bajo
Ph del jugo
gástrico la flora del estómago es mínima o
apenas existente, menos de 10 bacterias/ml, no siendo
necesariamente anaerobios estrictos.

La microbiota del intestino delgado es
bastante simple, con contajes de bacterias entre 103 y 105 por ml
y subiendo en el íleo terminal a 106/ml, donde la
proporción entre aerobios y anaerobios es muy similar;
Bacteroides y Bifidobacterium son los
anaerobios más comunes.

Cuando las bacterias llegan al intestino
delgado son sometidas a la acción
de los jugos intestinales, pancreático y biliar, al
peristaltismo y otros factores que tienen un evidente poder
antimicrobiano; por esta razón el número total de
bacterias en dicho lugar es habitualmente escaso y semejante al
de las partes superiores del aparato
digestivo, aunque con mayor número de Bacteroides
fragilis.

Más abajo, en el íleon y zona
colorectal, hay una gran cantidad de bacterias, pertenecientes a
más de 500 especies distintas; un 99% son anaerobias,
sobre todo Bacteroides, capaces de utilizar los alimentos no
digeridos previamente y vivir entre células
epiteliales, las cuales los utilizan y convierten en proteínas
asimilables, mucina y otras materias.

En el intestino grueso es donde el
número de bacterias es mayor; la concentración
llega hasta 1011 y 1012 de bacterias vivas por gramo de heces, lo
que representa un tercio del peso en seco. Las bacterias que
predominan son las anaerobias estrictas de los géneros
Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium,
Peptostreptococcus y Clostridium, junto con algunas
aerobias como las enterobacterias, pero en proporción
mucho más baja, de 1000 a 1. Son precisamente las
bacterias anaerobias el factor más importante en el
mantenimiento de la "resistencia a la
colonización". B. fragilis, aunque constituye
menos del 1% de la flora total del colon, es el que se aisla en
el 70% de las muestras clínicas de infecciones
intraabdominales, debido a que se adapta mejor al medio donde se
produce la alteración patológica.

4.4 Microbiota del tracto genital
femenino.

También en la vagina existe una
flora microbiana abundante y compleja en donde unas 20 especies
son las más habituales. La microbiota anaerobia es diversa
y compleja. Peptococcus, Peptostreptococcus, Bacteroides
y los bacilos Gram positivos como Eubacterium y
Clostridium son las bacterias que se aíslan con
más frecuencia. Prevotella se encuentra como
flora normal en más de un 20% de las mujeres.

La microbiota vaginal es relativamente
constante, pero varía ante las distintas circunstancias
fisiológicas de la mujer, como el
embarazo, el
puerperio, el uso de antimicrobianos, el empleo de
dispositivos intrauterinos, la toma de anticonceptivos, la menopausia, etc.

4.5 Actividades
fisiológicas.

Las bacterias anaerobias que constituyen la
microbiota del hombre tienen
un papel importante en procesos fisiológicos. Este aspecto
es de especial importancia a nivel del tubo digestivo, ya que la
flora intestinal tiene actividades de tipo metabólico.
Intervienen de forma significativa en el metabolismo de
los ácidos
biliares, pues poseen las enzimas
necesarias para tal fin. En la misma línea, hay que citar
la metabolización de aminoácidos, mediante
reacciones de desaminación o decarboxilación, de
forma que cuando disminuye la flora intestinal pueden aparecer
situaciones de malnutrición proteica, infantilismo y
alteraciones en el metabolismo de la urea y tiroxina.
Además, las bacterias anaerobias pueden sintetizar
vitaminas del
complejo B, así como ácido
fólico.

Síntomas
clínicos sugestivos de infección
anaeróbica

5.1 Distribución de anaerobios en muestras
clínicas:

Origen de las
infecciones anaeróbicas

Las bacterias anaerobias son la causa de
una gran diversidad de enfermedades en el hombre y
en los animales. Estas bacterias pueden proceder de fuentes
exógenas o endógenas.

Las bacterias anaerobias de la microbiota
del hombre y de los animales, son comensales o saprofitas con
carácter de oportunistas. Por tanto, son
invasores secundarios, siendo el acontecimiento primario la
difusión de la flora normal más allá de los
límites
de sus barreras mucocutáneas.

Los cuadros que originan estas bacterias
son inespecíficos, pudiendo afectar a cualquier
órgano o tejido y casi siempre son polimicrobianos.
Además, con bastante frecuencia son procesos de
etiología mixta, en ellos también están
involucrados de forma simultánea bacterias
aerobias.

6.1 INFECCIÓN ANAERÓBICA
DE ORIGEN EXÓGENO

Botulismo

Gastroenteritis por
Cl.perfringes

Mionecrosis (Gangrena gaseosa )

Tétano

Infección seguida de mordedura de
animal o humana

Aborto séptico

6.2 INFECCION ANAERÓBICA DE
ORIGEN ENDÓGENO

Absceso en cualquier
órgano

Actinomicosis

Complicación de
apendicitis

Mionecrosis clostridial

Endocarditis

Infección periodontal

Meningitis seguida de un absceso
cerebral

Osteomielitis

Las infecciones producidas por las
bacterias anaerobias ocurren en todas las partes del cuerpo
humano. Los tejidos infectados contienen generalmente una mezcla
de varias clases de anaerobios y también contienen con
frecuencia bacterias aerobias y facultativas. Los tipos de
infecciones producidas comúnmente por las bacterias
anaerobias son como sigue:

a) Infecciones intrabdominales. Los
abscesos, las infecciones postoperatorias de la herida y la
peritonitis generalizada producida por los anaerobios, ocurren
como consecuencia de la perforación del intestino durante
cirugías o por lesión.

b) Infecciones pulmonares. Las
infecciones anaerobias del pulmón pueden originarse en los
bronquios o la sangre. Las aspiraciones de la zona respiratoria
superior, que contienen una gran cantidad de bacterias
anaerobias, son responsables de iniciar la infección en
los bronquios.

c) Infecciones pélvicas. Las
infecciones anaerobias de la vagina y del útero ocurren a
veces después de cirugía ginecológica o en
la asociación con malignidad de órganos
pélvicos.

d) Abscesos del cerebro. Los
anaerobios producen infrecuentemente meningitis, pero son una
causa común de los abscesos del cerebro. Los organismos
que provocan la infección se originan generalmente en el
tracto respiratorio superior.

e) Piel e infecciones del tejido
suave. Las combinaciones de anaerobios, de aerobio, y de
organismos facultativos actúan a menudo
sinergísticamente para producir estas
infecciones.

f) Infecciones orales y dentales.
Estas infecciones locales se extienden con frecuencia a la cara,
el cuello y a veces a otras áreas del cuerpo tales como el
cerebro.

AREAS FRECUENTEMENTE AFECTADAS POR
ANAEROBIOS

6.3 INCIDENCIA DE INFECCIONES
ANAEROBICAS:

7- PROCESAMIENTO DE LA
MUESTRA:

7.1 Medios utilizados para el estudio de
anaerobios:

• 1. Brucella agar con 5% de sangre
  de carnero, suplementado con vitamina K y Hemina.
  También son útiles el Columbia y el Schaedler
  agar.

• 2. Bacteroides bili-esculina agar
  ( B. fragilis ).

• 3. Agar sangre con
  Kanamicina-Vancomicina. ( Bacteroides )

• 4. Agar alcohol fenil
  etílico. ( Inhibe entéricos. Muy útil
  para Bacteroides ).

• 5. Tioglicolato 135 sin indicador.
  Medio de enriquecimiento que puede suplementarse con vitamina
  K (0.1ug/ml ), Hemina (5 ug/ml ) o bicarbonato de sodio ( 1
  mg/ml ). Calentar en baño María por 10 minutos
  con la tapa floja.

Luego sacar, apretar la tapa y dejar
enfriar, antes de usar.

6. Carne molida-dextrosa. Para Clostridium,
visualización de esporas, determinación de toxinas
y mantenimiento de colonias.

7. Agar yema de huevo (C. perfringes y
cocos grampositivos anaeróbicos)

7.2 Sistemas para el cultivo de
anaerobios:

Los anaerobios pueden crecer en las placas
de agar en una atmósfera sin O 2, generalmente N 2 al 80%,
CO 2 al 10% e H 2 al 10%. El CO 2 estimula el crecimiento y el H
2 combinado con O 2 , que pueda estar presente, sirven para
mantener las condiciones anaerobias.

Algunos sistemas para el cultivo de
anaerobios son

• Técnica de jarra
  anaeróbica

• Técnica de cámaras de
  anaerobios

• Medios Pre-reducidos

Aunque existen varias técnicas
disponibles para mantener un ambiente libre de oxígeno
durante el procesamiento de los especimenes para el cultivo de
anaerobios, la jarra anaeróbica es la más
común.

7.2.1 Técnica de la jarra
anaeróbica:

Los diferentes sistemas de jarras
anaeróbicas incluyen la de Brewer, GasPak,
McIntosh-Fildes, Jarra Tolbar, entre otras.

Nos referiremos a la jarra GasPak, por ser
la de mayor utilidad en el
mundo.

El principio básico de ésta,
es como la de todas: La remoción del oxígeno
presente en la cámara ocurre por la reacción con el
hidrógeno producido, en presencia de un catalizador, para
formar agua. La
reacción se describe como 2H2 + O2 >>>
2H2O

El catalizador está compuesto de un
pellet de aluminio
revestido de 0.5 % de paladio. El catalizador puede ser
inactivado en la jarra por la producción de sulfuro de
hidrógeno u otros metabolitos volátiles producidos
por las bacterias. Por ello se recomienda que los catalizadores
sean reemplazados cada vez que se va a cerrar la jarra. Los
mismos pueden restaurar su actividad si son calentados a 160 –
170 ºC por 2 horas; luego de lo cual son almacenados en un
lugar seco y limpio a temperatura
ambiente.

El sobre generador de GasPak contiene un
papel de filtro, una tableta de borohidruro de sodio, una tableta
de bicarbonato de sodio y ácido cítrico. El sobre
es activado al añadir 10 ml de agua y el ambiente se
obtiene en aproximadamente 30 minutos, visualizándose por
una condensación del agua dentro de la jarra.

El sistema produce un potencial de
oxido-reducción ( Redox ) de -100 Mv dentro de

1 hora y – 200 Mv en 2 horas. Dentro de una
hora de incubación a 35 ºC , la concentración
de gases es de
aproximadamente 4 a 10% de CO2.

Las condiciones anaeróbicas pueden
ser monitoreadas utilizando un indicador de
óxido-reducción; una tira de papel de filtro
impregnada de azul de metileno puede ser utilizada con
éste propósito. El azul de metileno se degrada a
incoloro y permanece así mientras se mantengan las
condiciones de ausencia de oxígeno.

Si el la tira indicadora se observa azul,
hay falla en la producción del ambiente y los cultivos
deben ser repetidos. El azul de metileno se decolora en
aproximadamente

4 a 6 horas a 35 ºC.

Existen en mercado diversas
marcas para
generadores de ambientes, entre los que llama la atención el Genbox de bioMerieux que no
requiere agua para su activación ni catalizador. No
desprende Hidrógeno y requiere ser colocado en menos de 1
minuto en la jarra, ya que la reacción es
inmediata.

Normalmente el periodo de incubación
de los platos es de 48 h, sin embargo algunos requieren
más de 3 días como el Fusobacterium y algunos cocos
anaeróbicos. Generalmente el periodo máximo de
incubación es de 72 horas , con observación de los platos a las
48h.

JARRA DE BREWER

Hay otros procedimientos más
sofisticados que se utilizan para aislar los microorganismos
extremadamente oxígeno-sensitivos que no siempre pueden
ser recuperados usando la jarra anaeróbica.

7.3 Medios Pre-Reducidos
(PRAS):

En este método se preparan los
medios prerreducidos, se esterilizan, se almacenan en tubos
sellados y se les inocula un ambiente libre de oxígeno.
Siempre que los tubos se abran por ejemplo para la siembra de la
muestra, inoculaciones, transferencia etc., se protegen contra la
entrada del oxígeno haciendo pasar a través de
ellos y de manera continua, una corriente de gas libre de
oxígeno (bióxido del nitrógeno o de
carbono). Cada tubo es por lo tanto, su propia cámara de
anaerobiosis.

Un método muy práctico de
preparación, es el del medio prerreducido con
aguja.

Se prepararan tubos de caldo
infusión cerebro y corazón
(BHI) y tubos de BHI a los que se les incorporó un trozo
de carne de res de 0.5 cm de carne cocida desgrasada (BHI-carne),
prerreducidos, de acuerdo con las recomendaciones de Holdeman,
Cato y Moore, para garantizar una atmósfera completamente
anaeróbica.

Para crear la atmósfera anaerobia,
el medio de cultivo se dispone en volúmenes de

5 ml en tubos 16 x 100 mm con tapón
de hule (nuevo) y tapa de rosca a la que se le hizo un orificio
de 1 mm; a través de dicho orificio se introdujo una aguja
#27. Los tubos bien cerrados se esterilizaron durante 15 minutos
a 121 ºC. Concluido el ciclo de esterilización, se
procede a una descompresión rápida de la autoclave
y con guantes protectores se precede a sacar las agujas en cada
uno de los tubos que se encontraban aún en proceso de
ebullición. Los tubos se dejan enfriar a temperatura
ambiente y son descartados todos aquellos que presentaran
evidencia de oxidación, de acuerdo con el indicador de
resarzurina que tiene incorporado el medio.

7.3.1 El método del Roll-Tube
es una técnica popularizada por el Virginia
Polytechnic Institute (VIP), el cual consiste en un tubo con
tapa que contiene gas libre de oxígeno y una capa delgada
del medio prerreducido ( PRAS ) en su superficie interior. La
muestra se inocula mientras que se rota el tubo. Esto produce una
pista en espiral en la superficie del agar. El tubo se limpia con
una corriente de bióxido de carbono para prevenir la
entrada del aire mientras que esté abierto durante la
inoculación, con lo que el tubo al taparlo se convierte en
su propia cámara anaeróbica de cultivo.

7.4 La cámara de anaerobio
con guantes es otra innovación desarrollada para aislar
bacterias anaerobias. Es esencialmente un compartimiento grande
de vinil transparente, con los guantes unidos, conteniendo una
mezcla de 80 % de nitrógeno, 10 % de hidrógeno y 10
% de bióxido de carbono. Recordar que el H2 es
explosivo.

Un compartimento en un extremo de la
cámara contiene dos portillas, una que conduce al exterior
y la otra al interior del compartimiento. Los especimenes se
ponen en el compartimento, la portilla exterior es cerrada, y el
aire en el compartimento se evacua y se substituye por la mezcla
de gas. La portilla interior entonces se abre para introducir el
espécimen en la cámara principal cuando las
presiones se igualan. Una de las cámaras más
recomendadas es la de Forma Scientific(.

Cámara de
anaerobios

7.5 Principios
generales para el éxito
del cultivo:

• 1. Apropiada colección y
  transporte

• 2. Procesamiento de la muestra con
  la mínima exposición al
  oxígeno

• 3. Medio de cultivo fresco o
  prerreducido.

• 4. Uso de un sistema
  anaeróbico adecuado.

7.6 Características útiles
en la identificación de bacterias
anaeróbicas:

A pesar de que existen signos
bacteriológicos que sugieren crecimiento de organismos
anaeróbicos como morfología
celular típica en Gram, crecimiento en el área
profunda de un medio líquido, gas y mal olor en el
cultivo, los siguientes detalles ayudan a orientarnos en el
diagnóstico:

1. Morfología de la célula
y de la colonia

2. Producción de pigmento

3. Formación de
endosporas

4. Beta-hemólisis en agar de
sangre

5. Picaduras en el medio

6. Fluorescencia con la luz
ultravioleta

7. Movilidad

8. Índice de crecimiento

9. Olor característico del
cultivo

10. Producción de
catalasa

11. Crecimiento en presencia de bilis al
20%

12. Patrones específicos de la
susceptibilidad a los antibióticos

13. Efectos del cultivo en agar yema de
huevo

14. Producción de indol

15. Hidrólisis de la
esculina

16. Subproductos metabólicos
característicos de la fermentación de la glucosa

17. Producción de toxinas

7.7 Muestras no adecuadas para el
cultivo de anaerobios:

• a) Lavado bronquioalveolar
  desprotegido.

• b) Hisopo cervical.

• c) Aspirado
  endotraqueal.

• d) Loquios.

• e) Hisopo nasofaríngeo /
  Secreción faríngea.

• f) Líquido seminal o
  prostático.

• g) Esputo por expectoración
  o inducido.

• h) Heces, rectal, contenido
  gástrico, colostomía.

• i) Secreción uretral /
  hisopo vaginal o vulvar.

• j) Orina por vaciado directo o
  catéter.

Técnicas
para la identificación de bacterias
anaeróbicas

8.1 Pruebas de
Identificación Bacteriana:

8.1.1 Etanol- espora test

Sirve para separar bacilos esporulados de
los no esporulados, basado en la resistencia de las esporas al
alcohol.

• 1. Utilice un caldo de cultivo de
  48h

• 2. Adicione 1 ml del caldo de
  cultivo a un tubo conteniendo 1 ml de alcohol etílico
  al 95%.

• 3. Mezcle y deje reposar por 30 a
  45 minutos.

• 4. Introduzca un hisopo dentro del
  tubo y siembre en un plato de agar sangre.

• 5. Introduzca otro hisopo en el
  caldo original y siembre en plato de agar sangre. Este
  servirá de control para la pureza y viabilidad del
  microorganismo.

• 6. Incube ambos platos en ambiente
  anaeróbico a 35 ºC por 48 h.

• 7. Crecimiento en ambos platos
  indica la presencia de esporas.

8.1.2 Test de SIM en
Anaerobiosis por Esporas

Este test no está descrito en
ningún libro y fue
descubierto por nosotros de forma casual. Desde entonces por su
sencillez es utilizado en la mayoría de los laboratorios
del país.

• 1. Coloque la colonia en un tubo
  conteniendo medio para SIM (Movilidad).

• 2. Incube por 48h a 35 ºC en
  ambiente anaeróbico.

• 3. Si hay presencia de H2S, haga
  un frotis por Gram y un frotis por verde malaquita. ( 1
  minuto verde malaquita flameando 2 veces, lavado con agua,
  teñir con safranina por 1 minuto ).

• 4. El frotis teñido por
  verde malaquita demostrará la presencia de esporas
  (verdes), si el organismo tiene la capacidad de
  producirla.

Esporas oval sub-terminal. Frotis por
verde malaquita

8.1.3 Prueba de bilis al
20%

Esta prueba es útil para separar el
grupo de B.
fragilis bilis resistente, del resto de los bacteroides sp. La
prueba se puede hacer con disco impregnado de bilis, agar o tubo
de bilis test.

• 1. Haga una solución de
  bilis pura al 40%. Esterilice por autoclave.

• 2. Adicione 0.5 ml de bilis a 10
  ml de tioglicolato previamente hervido. Esto hace una
  concentración de 2% de bilis pura, equivalente a 20%
  de bilis.

• 3. Inocule al tubo de
  tioglicolato-bilis y a otro tubo de tioglicolato sin
  suplemento, 1 a 2 colonias de un plato puro de agar
  sangre.

• 4. Incube por 24 a 48h.

• 5. Compare el crecimiento en ambos
  tubos. La prueba es catalogada inhibición por bilis,
  si no hay crecimiento en el tubo de
  tioglicolato-bilis.

8.1.4 Lecitinasa Test

El componente lecitina, un componente
normal de la yema de huevo, es descompuesta por la enzima
lecitinasa en un diglicérido insoluble. Esto resulta en un
halo opaco en el medio conteniendo yema de huevo. Es un test
importante para los clostridium.

• 1. Inocule el medio McClung Toabe
  yema de huevo agar suplementado con emulsión de yema
  de huevo, con el organismo en plato de 24-48h de
  incubación.

• 2. Incube anaeróbicamente
  por al menos 24h a 35 ºC.

• 3. Examine por una opacidad blanca
  en el medio que rodea la colonia y que se extiende al final
  del crecimiento.

Clostridium novyi en agar yema de
huevo.

Reacción de Lecitinasa y Lipasa
positiva

8.1.5 Nagler Test

Cl. perfringes, barati,
bifermentans y sordelli producen una alfa
lecitinasa la cual es detectada por un test de
neutralización, utilizando perfringes antitoxina tipo A y
B.

• 1. Inocule la mitad de un plato de
  agar yema de huevo con la antitoxina.

• 2. Deje secar. Inocule el
  organismo a examinar en la otra mitad del plato libre de
  antitoxina y luego estriar a través del lado con
  antitoxina.

• 3. Incube anaeróbicamente
  por 24 a 48h a 35 ºC.

• 4. Examine por la pérdida
  de la turbidez en la mitad del plato con antitoxina, lo que
  demuestra la neutralización de la lecitinasa, lo cual
  es un test positivo.

Cl. perfringes- Nagler test positivo
en agar yema de huevo

Note la perdida de la actividad de la
Lecitinasa en el lado derecho, con antitoxina, comparado con el
agar limpio en el lado izquierdo, sin antitoxina

8.1.6 CAMP test reversa

Es similar al test para identificar
Estreptococos betahemolíticos del grupo "B" (EBHB),
excepto que en éste test, el clostridium reemplaza al S.
aureus.

El EBHB puede inhibir algo de la
hemólisis con otros clostridium y solo el

Cl. Perfringes muestra la
característica hemólisis en forma de cabeza de
flecha.

• 1. Utilice colonias frescas de
  clostridium y EBHB.

• 2. Inocule el Estreptococo en una
  sola línea en el agar sangre, en ángulo de
  90º con respecto a una línea de clostridium,
  haciendo una cruz.

• 3. Incube anaeróbicamente a
  35 ºC por 24 a 48h.

• 4. Una zona en forma de cabeza de
  flecha que indica una hemólisis sinergística,
  es una prueba positiva.

Cl. perfringes. CAMP test reversa
positiva

8.1.7 Test de ureasa en
caldo

Es útil para diferenciar algunos
clostridium, bacteroides y actinomyces.

• 1. Prepare una suspensión
  fuerte del organismo en un caldo de urea
  estéril.

• 2. Incube aeróbicamente a
  35 ºC por 24 h.

• 3. Un color morado brillante a
  rojo es una prueba positiva. Este cambio de color puede
  ocurrir entre 15 a 30 minutos.

Es útil para diferenciar
Bacteroides urealyticus de B. gracilis y B.
fragilis. También es útil para separar Cl.
sordellii del menos patogénico Cl.
Bifermentans.

  8.1.8 Indol:

• 1- Colocar una porción de la colonia
  sobre un pedazo de papel de filtro.

• 2-  Agregar una gota del reactivo.

• 3- Las colonias positivas dan un cambio
  inmediato cercano al color rosado.

• 4- Es Una prueba útil para distinguir
  entre Bacteroides spp. y Fusobacterium spp.
  y entre miembros de la familia del Peptostreptococcus spp. y
  clostridium spp.

8.1.9 Nitrato:

Es una prueba en disco de nitrato en 2 horas , la cual
es útil para diferenciar el grupo de B. fragilis
del grupo de B. ureolyticus, y el grupo de bacilos
grampositivos no esporulados que incluye al Propionibacterium
acnes y Eubacterium lentum ( ahora Eggerthella
lenta). Veillonella es también nitrato positivo.

 8.1.10 Catalasa:

Para el test de catalasa en anaerobios, se utiliza una
solución de H2O2 al 15%, lo cual parece ser más
sensible que la solución al 3% utilizada para
estafilococos.

Bacteroides fragilis y Bacteroides
thetaiotaomicron, son catalasa positiva, sin embargo, muchos
otros miembros e la familia del
Bacteroides fragilis son catalasa negativa.
Propionibacterium acnes es catalasa positiva y sin
embargo, Eubacterium lentum (Eggerthella lenta) es
negativa. El B.thetaiotaomicron convierte el
ácido litocólico en éster etílico. El
ácido litocólico puede ser un promotor de
tumores.

8.1.11 SPS:

El Polyanethol – sulfonato de sodio (SPS),
un anticoagulante comúnmente usado, inhibe ciertas
bacterias tales como el Peptostreptococcus anaerobius y
el aerobio Gardnerella vaginalis. Los discos de papel
impregnados con el SPS al 5% se pueden utilizar como herramienta
para distinguir P. anaerobius de otros cocos
anaerobios.

El P. anaerobius da generalmente
una zona muy grande de inhibición (> 166 mm), mientras
que otros cocos anaerobios que son susceptibles al SPS dan zonas
más pequeñas.

El Wadsworth Anaerobic Bacteriology
Manual recomienda que todos los laboratorios deban ser
capaces de identificar los anaerobios al menos hasta el nivel 1,
lo cual es definido como "Identificación presuntiva para
platos primarios". Esta información incluye
parámetros simples como reacción al Gram,
morfología y algunas pruebas bioquímicas
básicas.

• Causas de error en la
  investigación de anaerobios :

• 1. Aceptación para cultivo
  de muestras no recomendadas para anaerobios.

• 2. Falla en excluir flora normal
  durante la colección.

• 3. No evitar la entrada de aire
  durante la colección y transporte de la
  muestra.

• 4. Falla en los catalizadores e
  indicador.

• 5. No mantener los platos
  anaerobios en incubación por más
  tiempo.

• 6. Utilizar el método de
  Kirby-Bauer en la sensibilidad.

Anaerobios de
mayor importancia clínica

A – Bacilos GramNegativos

a) Bacteroides fragilis ( 12-23%
)

b) Bacteroides
melaninogenicus

c) Fusobacterium
nucleatum

B- Bacilos GramPositivos
Esporulados

a) Clostridium perfringes ( 5-10%
)

C- Bacilos GramPositivos No
Esporulados

a) Propionibacterium acnes ( 5-10%
)

D- Cocos Gram Positivos

a) Peptococcus asaccharolyticus (
9-10%)

b) Peptococcus anaerobius ( 8-9%
)

• Breve descripción de los
  anaerobios de mayor importancia :

Al presente existen más de una
docena de géneros de los bacilos Gram negativos
anaeróbicos estrictos. Sin embargo, en la mayoría
de las infecciones clínicas, solo los géneros
Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella y Fusobacterium, deben ser
considerados.

9.1.1 Bacteroides sp:

Bacteroides sp es tal vez la
bacteria mas numerosa del intestino, y también la bacteria
anaeróbica estricta de mayor importancia clínica.
Descrita originalmente en 1898 es un anaeróbico estricto,
Gram-negativo, pleomórfico, que no se podrían
asignar convincentemente a ninguna otro género. El
análisis fisiológico de este
género reveló heterogeneidad considerable con
respecto a sus características bioquímicas,
indicando que estas bacterias no representaban un grupo
filogenético verdadero. De acuerdo con esta
información, se ha repartido los miembros grupo
Bacteroides original en tres géneros: Bacteroides,
Prevotella, y Porphyromonas. Esta definición
restringe el Bacteroides a diez especies.

El B. fragilis es el organismo
anaerobio más común aislado de infecciones
clínicas y los casos no tratados tienen
un índice de mortalidad del 60% , especialmente por su
capacidad de hacer resistencia a los antibióticos. Esta
mortalidad se puede disminuir grandemente con uso de la terapia
antimicrobiana apropiada.

9.1.1.1 Factores de virulencia del
Bacteroides.

• Cápsula
  polisacárida

• Enzimas histolíticas

• Lipopolisacárido

• Tolerancia al oxígeno

• Aglutininas

• Beta lactamasa

 La Cápsula Polisacárida es
detectable mediante tinción y técnicas
inmunológicas. La cápsula es antifagocítica
y favorece a la formación de abscesos. Los B.
frágiles encapsulados se adhieren a las superficies
peritoneales con mayor efectividad que las no encapsuladas, por
sus aglutininas, por lo que éste microorganismo se asocia
a más del 80% de las infecciones intraabdominales. Es
probable que la adherencia interfiera con la eliminación
de las bacterias mediadas por macrófagos.

9.1.1.2 Características fundamentales de
infecciones por bacteroides son:

• Origen endógeno.

• Aparecen como infecciones mixtas con otros
  gérmenes.

• Tendencia a formar abscesos.

9.1.1.3 Sindromes clínicos:

• B .fragiles se asocia con
  supuración, peritonitis por lesión intestinal,
  osteomielitis, neumonías, endocarditis, septicemia y
  abscesos en pulmón, tubo digestivo, ATO (absceso tubo
  ovárico).

• Establecida la infección, la población
  se puede extender desde las superficies mucosas hasta los
  tejidos o líquidos estériles sobre todo en
  casos de traumatismo o enfermedad previa.

• Las bacterias encapsuladas como B. fragiles
  desempeñan un papel destacado en infecciones y
  conducen a la formación de abscesos.

• Las infecciones se localizan en zonas
  próximas a las mucosas colonizadas.

Se aísla en el 15 al 20% de
infecciones pleuropulmonares, en dos tercios de infecciones
pélvicas supuradas y en todas las infecciones
intraabdominales con formación de abscesos.

9.1.1.4 Diagnóstico de
laboratorio:

El examen microscópico de las muestras puede
tener utilidad cuando se sospecha una infección por
anaerobios. Aunque las bacterias quizá se tiñen
poco y de forma irregular, la presencia de bacilos Gram negativos
pleomórficos puede suponer una información
preliminar útil.

B. fragilis se puede identificar además
por la resistencia a Kanamicina, Vancomicina y Colistina y el
crecimiento en bilis al 20%. Es indol negativo, catalasa
positiva, hidrólisis de esculina positiva, fermenta la
glucosa y lactosa.

9.1.1.5 Susceptibilidad a los
antimicrobianos:

La terapia antibiótica combinada con
intervención quirúrgica supone la estrategia
principal para controlar las infecciones serias por anaerobios.
Producen B-lactamasa por lo que son resistentes a penicilinas y
cefalosporinas. Sin embargo se pueden emplear concentraciones
altas de Carbenicilina, Piperacilina, inhibidores de la
B-lactamasa y otros antibióticos B-lactámicos
seleccionados como: Cefoxitina, imipenem. El Metronidazol es
activo contra la mayoría de los Bacteroides.

El Bacteroides es potencialmente resistente
a una amplia gama de antibióticos. La resistencia a
Clindamycina y a Eritromicina ha aumentado lenta pero
constantemente durante los últimos años.
Metronidazol también es una posibilidad
terapéutica.